ГЕНОМІКА ЧАЛАВЕКА
генетыка прыроды
Секвеніраванне доўгага чытання вызначае пашырэнне паўтораў GGC у NOTCH2NLC, звязанае з хваробай унутрыядзернага ўключэння нейронаў
АНТ рэсеквеніраванне |Ілюміна |Секвеніраванне ўсяго экзома |Мэтавае секвеніраванне CRISPR-Cas9 ONT |РНК-паслядоўнасць |Выклік метылявання ONT 5mC
Асноўныя моманты
1.Аналіз сувязяў у вялікай сям'і NIID выявіў дзве звязаныя вобласці.
2. Секвеніраванне працяглага чытання на аснове ONT і апасродкаванае ўзбагачэнне Cas-9. Секвенаванне ONT выявіла патэнцыйную генетычную прычыну пашырэння паўтораў NIID, GGC у 5' UTR NOTCH2NLC.Гэта даследаванне ўпершыню паведаміла аб паўторных пашырэннях у спецыфічных для чалавека генах, якія развіліся праз сегментарнае дубліраванне.
3. Секвенирование РНК выявіла анамальныя антысэнсавыя стэнаграмы ў пачатку або ўнутры абласцей пашырэння паўтораў GGC у NOTCH2NLC.
Фон
NХвароба ўнутрыядзерных уключэнняў унутры ядра (НИИВ) - прагрэсавальнае і смяротнае нейродегенеративное захворванне, якое характарызуецца наяўнасцю эозінофільных гиалиновых ўнутрыядзерных уключэнняў у цэнтральнай і перыферычнай нервовай сістэмах.Яе вельмі варыятыўныя клінічныя праявы выклікаюць вялікія цяжкасці ў дыягностыцы аж да ўвядзення біяпсіі скуры.Аднак метады, заснаваныя на гістапаталогіі, па-ранейшаму пакутуюць ад памылковага дыягназу, што патрабуе генетычнага разумення NIID.
Дасягненні
Аналіз сувязей
SНа вялікай сям'і NIID (13 пацярпелых і 7 незакранутых членаў) было выканана секвеніраванне цэлага геному (WGS) і секвеніраванне цэлага экзома (WES), заснаванае на секвеніраванні па прынцыпе хуткага чытання.Аналіз сувязі на SNP, выняты з гэтых даных, выявіў толькі дзве звязаныя вобласці: вобласць 3,5 Мб у 1p36.31-p36.22 (максімальны LOD=2,32) і вобласць 58,1 Мб у 1p22.1-q21.3 (максімальны LOD: 4,21). ).Аднак у гэтых звязаных рэгіёнах не было выяўлена патагенных SNP або CNV.
GGC паўторнае пашырэнне ў NOTCH2NLC
Nсеквенирование на аснове анопор было апрацавана на 13 пацярпелых і 4 незакранутых членах з 8 сем'яў (яшчэ адзін пацярпелы член быў секвенирован на платформе доўгага чытання секвенирования Pacbio.).Даўно прачытаныя дадзеныя паказалі пашырэнне паўтораў GGC, звязанае з захворваннем, у 5' UTR гена NOTCH2NLC, адлюстраванага ў звязаным рэгіёне памерам 58,1 Мб (малюнак 1).Гэтыя паўторныя пашырэнні былі таксама выяўлены ва ўсіх 40 спарадычных выпадках NIID, правераных з дапамогай RP-PCR.
Cапасродкаванае паслядоўнасць мэтаў as-9 на нанапоравай платформе выкарыстоўвалася для дасягнення большага ахопу чытання пры паўторы NOTCH2NLC (100 X-1795 X).Гэтыя кансэнсусныя паслядоўнасці добра адпавядаюць папярэднім высновам аб пашырэнні паўтораў GGC.Больш за тое, паўторы {(GGA)n (GGC)n}n былі ідэнтыфікаваны як патэнцыйны генетычны маркер фенатыпу з дамінантай слабасці (малюнак 2).
Малюнак 1. Звязанае з захворваннем паўторнае пашырэнне, выяўленае ў экзоне 1 ізаформ NOTCH2NLC.
Малюнак 2. Кансенсусныя паслядоўнасці паўтораў NPTCH2NLC у пацыентаў з NIID з (*) або без фенатыпу з дамінантай слабасці
NГены OTCH2NL - гэта спецыфічныя гены чалавека, якія, як мяркуюць, гуляюць жыццёва важную ролю ў эвалюцыі мозгу чалавека і неўралагічных захворваннях.Аднак тры звязаныя з NOTCH2 гены (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB і NOTCH2NLC) з ідэнтычнасцю паслядоўнасці >99,1% не былі вырашаны да апошняй зборкі геному чалавека.Секвеніраванне без сінтэзу і працяглага чытання на платформе нанапор паказала прыкметныя перавагі ў вызначэнні абласцей з высокім падабенствам і паўтораў (GGC)n са 100% багатым GC.
GGC паўторнае пашырэнне ў NOTCH2NLC
Tсеквенирование ранкриптома было апрацавана на 2 пацярпелых і 2 незакранутых членах.Нармалізаваная глыбіня счытвання была разлічана на сэнсавых і антысэнсавых ланцугах вышэй па плыні першых экзонаў паралагаў NOTCH2NL.Анамальныя антысэнсавыя стэнаграмы былі знойдзены толькі ў пацярпелых выпадках, якія знаходзяцца ў пачатку або ўнутры вобласці паўторнага пашырэння (фіялетавыя пікі ў F1-14 і F1-16 на малюнку 3.).Акрамя таго, былі ідэнтыфікаваныя 54 DEG, і ўсе яны былі ўзбагачаны тэрмінамі GO і MPO, звязанымі з функцыямі нейронаў.
Малюнак 3. Нармалізаваная глыбіня счытвання вышэй за першы экзон NOTCH2NLC у незакранутых (уверсе) і здзіўленых (унізе) выпадках.
Тэхналогіі
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nанопорнае секвенирование адрозніваецца ад іншых платформаў секвенирования тым, што нуклеатыды счытваюцца непасрэдна без працэсу сінтэзу ДНК.Калі адзін ланцуг ДНК праходзіць праз бялковую пору (нанапору) нанапамеру, розныя нуклеатыды генеруюць розныя іённыя токі, якія можна ўлоўліваць і перадаваць у паслядоўнасць асноў.Сама платформа секвеніравання ONT не паказвае відавочных тэхнічных абмежаванняў на даўжыню счытвання ДНК.Такім чынам, ультрадоўгія чытанні (ULR) даступныя для зборкі геному высокай якасці.Больш за тое, гэтыя надзвычай доўгія чытанні, якія дастаткова доўгія, каб перасекчы складаныя асаблівасці паслядоўнасці або структурныя варыяцыі, дапамагаюць пераадолець абмежаванні секвенирования кароткага чытання.
Секвеніраванне нанапор
Ідэнтыфікацыя змены структуры (SV).
Sсеквенирование без сінтэзу ў значнай ступені захавала інфармацыю аб метыляванні ДНК на шаблоне.Метыляваныя A, T, C і G ствараюць розныя іённыя токі ад неметыляваных, якія можна прачытаць непасрэдна платформай.Секвеніраванне нанапор дае магчымасць прафілявання ўсяго геному як 5 мКл, так і 6 мА з раздзяленнем аднаго нуклеатыду.
Даведка
Джун Соне і інш.інш.Секвеніраванне доўгага чытання вызначае пашырэнне паўтораў GGC у NOTCH2NLC, звязанае з захворваннем унутрыядзернага ўключэння нейронаў.Генетыка прыроды (2019)
Тэхналогія і асноўныя моманты імкнецца падзяліцца апошнім паспяховым прымяненнем розных высокапрадукцыйных тэхналогій секвеніравання ў розных даследчых сферах, а таксама бліскучымі ідэямі ў галіне распрацоўкі эксперыментаў і аналізу даных.
Час публікацыі: 6 студзеня 2022 г