METAGENOMIKA
Nanopor sekvensiyasından istifadə edərək mikrobiomlardan tam, qapalı bakterial genomlar
Nanopore Sequencing |Metagenomika |MAGs |Bakterial genomun sirkulyarizasiyası |Bağırsaq mikrobiotası
Vurğulananlar
1. Bu tədqiqatda 300 mq nəcisdən uzun müddət oxumaq üçün uyğun HMW DNT-nin mikroqramının çıxarılmasına nail olan uzun DNT fraqmentlərini çıxarmaq üçün yeni bir üsul təqdim edilmişdir.
2. Bu işdə MAG-lərin uzun oxunuşlarla yığıldığı və qısa oxunmalarla düzəldildiyi montaj iş prosesi, Torna təqdim edildi.
3. Torna saxta qarışıqla qiymətləndirilmişdir.12 bakteriyadan 7-si müvəffəqiyyətlə tək kontiglərə, 3-ü isə dörd və ya daha az kontiqaya yığıldı.
4. Torna daha sonra Prevotella copri və namizəd Cibiobacter sp., mobil genetik elementlərlə zəngin olması ilə tanınırdı.
Əsas Nailiyyət
HWM DNT üçün ekstraksiya protokolu
Uzun müddət oxunan ardıcıllığa əsaslanan bağırsaq metagenomik tədqiqatları uzun müddət nəcisdən yüksək molekulyar ağırlıqlı (HMW) DNT çıxarmaqda sərtlikdən əziyyət çəkmişdir.Bu işdə ənənəvi üsullarla muncuq döyməklə geniş kəsilmənin qarşısını almaq üçün ferment əsaslı ekstraksiya protokolu təqdim edilmişdir.Aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi, nümunələr hüceyrə divarlarını parçalamaq üçün əvvəlcə fermentlər, o cümlədən litik ferment, MetaPolyzyme və s. kokteyli ilə müalicə olundu.Buraxılmış DNT Fenol-xloroform sistemi, ardınca Proteinaz K və RNase A həzm, sütun əsaslı təmizləmə və SPRI ölçüsü seçimi ilə çıxarıldı.Bu üsul 300 m nəcisdən mikroqram HMW DNT əldə etməyə müvəffəq oldu ki, bu da həm keyfiyyət, həm də kəmiyyət baxımından uzun müddət oxunan ardıcıllıq tələblərini yerinə yetirir.
Şəkil 1. HWM DNT ekstraksiya sxemi
Torna dəzgahının sxem axını
Aşağıdakı şəkildə təsvir edildiyi kimi, Torna Guppy istifadə edərək xam əsas çağırış prosesinin mövcud prosesini ehtiva edir.Daha sonra Flye və Canu tərəfindən uzun müddət oxunmuş iki məclis istehsal olunur, ardınca səhv montajın aşkarlanması və çıxarılması aparılır.İki alt məclis sürətli birləşmə ilə birləşdirilir.Birləşdikdən sonra, meqabaza səviyyəsindəki böyük yığıncaqlar daha sonra dövriyyə üçün yoxlanılır.Sonradan bu məclislər üzrə konsensusun dəqiqləşdirilməsi qısa oxunuşlarla işlənir.Son yığılmış bakterial genomlar səhv montajın aşkar edilməsi və çıxarılması üçün işlənir.
Şəkil 2. Torna qurğusunun sxem axını
Tornanın saxta bakteriya qarışığı ilə qiymətləndirilməsi
MAG montajında nanopor sıralama platformasının və Torna tezgahının işini qiymətləndirmək üçün həm Qram-müsbət, həm də Qram-mənfi bakteriyalardan ibarət standart ATCC 12 növlü qarışıq istifadə edilmişdir.Cəmi 30,3 Gb məlumat 5,9 kb-lik N50 ilə nanopor platforması tərəfindən yaradılıb.Torna dəzgahı N50 montajını uzun müddət oxunan digər montaj alətləri ilə müqayisədə 1,6-4 dəfə və hibrid montaj alətləri ilə müqayisədə 2-9 dəfə yaxşılaşdırdı.12 bakteriya genomundan yeddisi tək kontiglərə yığılmışdır (Şəkil 3. Qara nöqtəli sirklər).Daha üçü dörd və ya daha az kontigdə yığıldı, ən natamam birləşmədə genomun 83%-i tək kontigədə idi.
Şəkil 3. Müəyyən edilmiş 12 növ bakterial qarışıqda genom birləşmələri
Tornanın nəcis nümunələrində tətbiqi
Bu üsul daha sonra orqanizmin identifikasiyası və yığılma bitişikliyini mövcud metodlarla müqayisə etmək, oxu-bulud və qısa oxumaq əsaslı analiz üçün insan nəcis nümunələrinə tətbiq edilmişdir.İştirak edilən üç nümunədən ferment əsaslı yeni ekstraksiya 300 mq giriş kütləsi üçün ən azı 1 μq məhsul verdi.Bu HMW DNT-nin nanopore ardıcıllığı müvafiq olaraq 4,7 kb, 3,0 kb və 3,0 kb N50 ilə uzun oxunuşlar yaratdı.Qeyd etmək lazımdır ki, mövcud metod mövcud üsullarla müqayisədə mikrobların aşkarlanmasında böyük potensial nümayiş etdirir.Qısa oxunan və oxunan buludla müqayisədə burada nisbətən yüksək növ səviyyəli alfa müxtəlifliyi göstərildi.Üstəlik, qısa oxunan analizdən bütün cinslər, hətta adətən lizisə davamlı qram-müsbət orqanizmlər də bu üsulla bərpa edildi.
Şəkil 4. Nanopore, qısa oxumaq və oxumaq-bulud üsulları ilə müəyyən edilən alfa müxtəlifliyi və taksanomik komponentlər
Torna dəzgahı, xam məlumatların üç-altı qat daha az daxil edilməsinə baxmayaraq, qısa oxunan və oxunan buludlu montajdan daha uzun N50 tam yığılması verdi.Qaralama genomlar tamlıq, çirklənmə, tək nüsxə nüvəli genlər və s. əsaslanaraq “yüksək keyfiyyətli” və ya “qismən” olaraq təsnif edildiyi kontig binning üsulu ilə istehsal edildi. qısa oxumaq və bulud oxumaq.
Şəkil 5. Hər bir metodun orqanizm başına yığılması bitişikliyi
Üstəlik, hazırkı montaj yanaşması qapalı, dairəvi genomlar verməyə qadirdir.Nəcis nümunələrində səkkiz yüksək keyfiyyətli, tək kontiqallı genom yığıldı və bunlardan beşində dəqiq dairəviləşmə əldə edildi.Uzun müddət oxunan yanaşma genomlarda təkrarlanan elementləri həll etməkdə də təsirli qabiliyyət nümayiş etdirdi.DairəviləşdirilmişP. coprigenom yüksək ardıcıllıq təkrarını ehtiva edən bu yanaşma ilə yaradıldı.Qısa oxunan və oxunan buludla bu genomun ən yaxşı yığılması heç vaxt N50-ni 130 kb, hətta 4800X əhatə dərinliyi ilə də keçmir.Bu yüksək nüsxə sayı elementləri çox vaxt qısa oxunan və ya oxunan buludlu birləşmələrin qırılma nöqtələrində tapılan uzun-oxuyan yanaşma ilə tam həll edildi.Bu araşdırmada daha bir qapalı genom bildirildi və bu genomun yaxınlarda təsvir edilən üzvü olduğuna inanılırdıCibiobactertəbəqə.Bu qapalı məclisdə 8,5 ilə 65,9 kb arasında dəyişən beş ehtimal olunan faq müəyyən edilmişdir.
Şəkil 6. P.copri və Cibiobacter sp qapalı genomlarının sirkos diaqramı.
İstinad
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Nanopor sekvensiyasından istifadə edərək mikrobiomlardan tam, qapalı bakterial genomlar.Təbiət biotexnologiyası,38(6), 701-707.
Tech və Highlights müxtəlif tədqiqat arenalarında müxtəlif yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllıq texnologiyalarının ən son uğurlu tətbiqini, eləcə də eksperimental dizayn və məlumatların əldə edilməsində parlaq fikirləri bölüşmək məqsədi daşıyır.
Göndərmə vaxtı: 07 yanvar 2022-ci il