الجينوم البشري
علم الوراثة الطبيعة
يحدد تسلسل القراءة الطويلة توسعات تكرار GGC في NOTCH2NLC المرتبطة بمرض الشمول النووي داخل الخلايا العصبية
إعادة تسلسل ONT |الومينا |تسلسل إكسوم كامل |كريسبر-كاس9 ONT التسلسل المستهدف |RNA-seq |ONT 5mC استدعاء مثيلة
يسلط الضوء
1. من خلال تحليل الارتباط على عائلة كبيرة من NIID، تم تحديد منطقتين مرتبطتين.
2. اكتشف تسلسل القراءة الطويلة القائم على ONT وتسلسل ONT للتخصيب بوساطة Cas-9 سببًا وراثيًا محتملاً لـ NIID وتوسعات GGC المتكررة في 5 ′ UTR من NOTCH2NLC.أبلغت هذه الدراسة عن توسعات متكررة في الجينات الخاصة بالإنسان لأول مرة والتي تطورت من خلال التكرارات القطاعية.
كشف تسلسل 3.RNA عن نصوص مضادة غير طبيعية في البداية أو داخل مناطق توسع تكرار GGC في NOTCH2NLC.
خلفية
Nمرض الاشتمال داخل النووي الأوروبي (NIID) هو مرض تنكس عصبي تقدمي ومميت، والذي يتميز بوجود شوائب داخل النواة الهيالينية اليوزينية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي.تثير مظاهره السريرية المتغيرة للغاية صعوبات كبيرة في التشخيص حتى يتم إدخال خزعة الجلد.ومع ذلك، فإن الأساليب المعتمدة على التشريح المرضي لا تزال تعاني من التشخيص الخاطئ، الأمر الذي يدعو إلى الفهم الجيني للـ NIID.
الإنجازات
تحليل الارتباط
Sتم إجراء تسلسل الجينوم الكامل (WGS) وتسلسل الإكسوم الكامل (WES) على أساس تسلسل القراءة القصيرة على عائلة NIID كبيرة (13 عضوًا متأثرًا و7 أعضاء غير متأثرين).كشف تحليل الارتباط على SNPs المستخرج من هذه البيانات عن منطقتين مرتبطتين فقط: منطقة 3.5 ميجا بايت عند 1p36.31-p36.22 (الحد الأقصى لـ LOD = 2.32) ومنطقة 58.1 ميجا بايت عند 1p22.1-q21.3 (الحد الأقصى لـ LOD: 4.21) ).ومع ذلك، لم يتم تحديد أي تعدد الأشكال المسببة للأمراض أو CNVs في هذه المناطق المرتبطة.
كرر GGC التوسعات في NOTCH2NLC
Nتمت معالجة التسلسل المستند إلى anopore على 13 عضوًا متأثرًا و4 أعضاء غير متأثرين من 8 عائلات (تمت تسلسل عضو متأثر آخر بواسطة منصة Pacbio للتسلسل طويل القراءة).كشفت البيانات طويلة القراءة عن توسعات تكرار GGC المرتبطة بالمرض في 5 ′ UTR لرسم خرائط الجينات NOTCH2NLC إلى المنطقة المرتبطة بـ 58.1 ميجا بايت (الشكل 1).تم تحديد هذه التوسعات المتكررة أيضًا في جميع حالات NIID الأربعين المتفرقة التي تم اختبارها بواسطة RP-PCR.
Cتم استخدام التسلسل المستهدف بوساطة as-9 على منصة nanopore لتحقيق تغطية قراءة أعلى عند تكرار NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).اتفقت هذه التسلسلات المتفق عليها جيدًا مع النتائج السابقة بشأن توسعات تكرار GGC.علاوة على ذلك، تم تحديد التكرارات {(GGA)n (GGC)n}n كعلامة وراثية محتملة للنمط الظاهري المهيمن على الضعف (الشكل 2).
الشكل 1. تم تحديد توسع التكرار المرتبط بالمرض على إكسون 1 من الأشكال الإسوية NOTCH2NLC.
الشكل 2. تكرار تسلسلات الإجماع لـ NPTCH2NLC في مرضى NIID الذين يعانون من (*) أو بدون النمط الظاهري المهيمن على الضعف
Nجينات OTCH2NL هي جينات خاصة بالإنسان، والتي يعتقد أنها تلعب دورًا حيويًا في تطور الدماغ البشري والأمراض العصبية.ومع ذلك، لم يتم حل ثلاثة جينات مرتبطة بـ NOTCH2 (NOTCH2NLA، وNOTCH2NLB، وNOTCH2NLC) ذات هوية تسلسل> 99.1٪ حتى آخر تجميع للجينوم البشري.أظهر التسلسل الخالي من التوليف والقراءة الطويلة على منصة nanopore مزايا ملحوظة في حل المناطق ذات التشابه العالي وتكرار (GGC)n بنسبة 100٪ غنية بـ GC.
كرر GGC التوسعات في NOTCH2NLC
Tتمت معالجة تسلسل ranscriptome على عضوين متأثرين وعضوين غير متأثرين.تم حساب عمق القراءة الطبيعي على خيوط المعنى والمعاكس في المنبع من الإكسونات الأولى من نظائرها NOTCH2NL.تم العثور على نسخ غير طبيعية مضادة للإحساس فقط في الحالات المصابة، والتي تقع في البداية أو داخل منطقة التوسع المتكررة (القمم الأرجوانية في F1-14 وF1-16 في الشكل 3.).بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد 54 DEGs وتم إثرائها جميعًا بمصطلحات GO وMPO المتعلقة بالوظائف العصبية.
الشكل 3. عمق القراءة الطبيعي عند المنبع للإكسون الأول لـ NOTCH2NLC في الحالات غير المتأثرة (أعلاه) والمتأثرة (أدناه).
تكنولوجيا
تقنيات أكسفورد نانوبور (ONT)
Nيميز تسلسل anopore نفسه عن منصات التسلسل الأخرى، حيث تتم قراءة النيوكليوتيدات مباشرة دون عملية تخليق الحمض النووي.عندما يمر الحمض النووي المفرد عبر مسام بروتيني بحجم النانو (نانوبور)، تولد النيوكليوتيدات المختلفة تيارات أيونية مختلفة، والتي يمكن التقاطها ونقلها إلى تسلسل من القواعد.لا تُظهر منصة تسلسل ONT نفسها حدًا تقنيًا واضحًا لطول قراءة الحمض النووي.ولذلك، تتوفر القراءات الطويلة جدًا (ULRs) لتجميع الجينوم بجودة عالية.علاوة على ذلك، فإن هذه القراءات الطويلة للغاية، والتي تكون طويلة بما يكفي لعبور ميزات التسلسل المعقد أو الاختلاف الهيكلي، تساعد في التغلب على قيود تسلسل القراءة القصيرة هنا.
تسلسل النانو
تحديد تباين الهيكل (SV).
Sيحافظ التسلسل الخالي من التوليف على معلومات مثيلة الحمض النووي إلى حد كبير في القالب.تولد الميثيلات A وT وC وG تيارات أيونية متميزة عن التيارات غير الميثلية، والتي يمكن قراءتها مباشرة بواسطة المنصة.يعمل تسلسل Nanopore على تمكين تحديد ملامح الجينوم الكامل لكل من 5mC و6mA عند دقة النوكليوتيدات الفردية.
مرجع
جون سون وآخرون.آل.يحدد تسلسل القراءة الطويلة توسعات تكرار GGC في NOTCH2NLC المرتبطة بمرض الشمول النووي داخل الخلايا العصبية.علم الوراثة الطبيعية (2019)
التكنولوجيا ويسلط الضوء يهدف إلى مشاركة أحدث التطبيقات الناجحة لمختلف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية في مختلف مجالات البحث بالإضافة إلى الأفكار الرائعة في التصميم التجريبي واستخراج البيانات.
وقت النشر: 06 يناير 2022