በአይሶፎርም-ደረጃ AS ጥናት ውስጥ የናኖፖሬ የሙሉ ርዝመት ትራንስክሪፕት ቅደም ተከተል አተገባበር

ትራንስክሪፕቶሚክስ

ተፈጥሮ
መገናኛዎች

ሥር በሰደደ የሊምፎይቲክ ሉኪሚያ ውስጥ የSF3B1 ሚውቴሽን የሙሉ-ርዝመት ግልባጭ ባህሪ የተያዙ ኢንትሮኖች መውረድን ያሳያል።

ባለሙሉ ርዝመት ግልባጮች|የናኖፖር ቅደም ተከተል|አማራጭ isoform ትንተና

ዳራ

Somatic mutations in splicing factor SF3B1 ሥር የሰደደ ሊምፎይቲክ ሉኪሚያ (ሲኤልኤል)፣ uveal melanoma፣ የጡት ካንሰር፣ ወዘተ ጨምሮ ከተለያዩ ነቀርሳዎች ጋር እንደሚዛመድ በስፋት ተዘግቧል። በተጨማሪም በአጭር ጊዜ የተነበቡ የጽሑፍ ግልባጭ ጥናቶች በSF3B1 ሚውቴሽን ምክንያት የሚመጡ የተበላሹ የስፕሊንግ ንድፎችን አረጋግጠዋል።ነገር ግን፣ በነዚህ አማራጭ የስፕሊንግ ቅጦች ላይ የተደረጉ ጥናቶች ከረዥም ጊዜ ጀምሮ በክስተት ደረጃ እና በአይሶፎርም ደረጃ ላይ ያለ ዕውቀት ማነስ የተገደቡ በአጭር የተገጣጠሙ የተገለበጡ ቅጂዎች ውስንነት ነው።እዚህ፣ የናኖፖር ቅደም ተከተል መድረክ የሙሉ ርዝመት ግልባጮችን ለማመንጨት አስተዋወቀ፣ ይህም በAS isoforms ላይ መመርመርን አስችሎታል።

የሙከራ ንድፍ

ሙከራዎች

መቧደን፡1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E ሚውቴሽን);3. መደበኛ ቢ-ሴሎች
የቅደም ተከተል ስልት፡MiniION 2D ቤተመፃህፍት ቅደም ተከተል፣ PromethION 1D ቤተመፃህፍት ቅደም ተከተል;አጭር-ተነባቢ ውሂብ ከተመሳሳይ ናሙናዎች
የመድረክ ቅደም ተከተልONT ሚንዮን;ONT PromethION;

ባዮኢንፎርማቲክ ትንታኔ

ውጤቶች

ሀበአጠቃላይ 257 ሚሊዮን ንባቦች ከ6 CLL ናሙናዎች እና 3 ቢ-ሴሎች ተፈጥረዋል።ከእነዚህ ንባብ ውስጥ በአማካይ 30.5% የሙሉ ርዝመት ግልባጮች ተለይተዋል።

Fባለ ሙሉ ርዝመት አማራጭ የአይዞፎርም ትንተና አር ኤን ኤ(FLAIR) የተዘጋጀው ከፍተኛ እምነት ያላቸው አይሶፎርሞች ስብስብ ለመፍጠር ነው።FLAIR እንደሚከተለው ሊጠቃለል ይችላል፡-

Nአኖፖሬ አሰላለፍ ያነባል-በማጣቀሻ ጂኖም ላይ በመመስረት አጠቃላይ የጽሑፍ አወቃቀሩን መለየት;

Splice junction እርማት፡ ትክክለኛ ቅደም ተከተል ስህተቶች(ቀይ) ከተሰነጣጠለ ቦታ ጋር ከተብራራ ኢንትሮኖች፣ ከአጭር የተነበበ ውሂብ ወይም ከሁለቱም;

Collapse፡ በስፕሊስ መጋጠሚያ ሰንሰለቶች (የመጀመሪያ ማለፊያ ስብስብ) ላይ በመመስረት የተወካይ ኢሶፎርሞችን ማጠቃለል።በሚደግፉ ንባቦች ብዛት ላይ በመመስረት ከፍተኛ እምነት ያለው isofrom ይምረጡ (ገደብ፡ 3)።

ምስል 1. በ CLL ውስጥ ከ SF3B1 ሚውቴሽን ጋር የተዛመዱ ሙሉ-ርዝመት ኢሶፎርሞችን ለመለየት የFLAIR ትንተና

FLAIR ለይቶ 326,699 ከፍተኛ እምነት የሚጣልባቸው አይሶፎርሞች፣ 90% የሚሆኑት ልብ ወለድ isoforms ናቸው።አብዛኛዎቹ እነዚህ ያልተብራሩ ኢሶፎርሞች የታወቁ የስፕሊስ መገናኛዎች (142,971) ልብ ወለድ ውህዶች ሆነው የተገኙ ሲሆን የተቀሩት ልብ ወለድ isoforms ግን የተያዘ ኢንትሮን(21,700) ወይም ልብ ወለድ exon(3594) ናቸው።

Lየንባብ ቅደም ተከተሎች የሚውቴሽን SF3B1-K700E -የተቀየሩ የተከፋፈሉ ቦታዎችን በአይሶፎርም ደረጃ መለየትን ያበረታታል።35 አማራጭ 3'SSs እና 10 አማራጭ 5'SSs በSF3B1-K700E እና SF3B1-WT መካከል በከፍተኛ ሁኔታ የተከፋፈሉ ሆነው ተገኝተዋል።ከ35ቱ ለውጦች 33ቱ አዲስ የተገኙት ለረጅም ጊዜ በተነበቡ ቅደም ተከተሎች ነው።በናኖፖሬ መረጃ፣ በSF3B1-K700E-የተቀየረ 3'SS መካከል ያለው ርቀት ወደ ቀኖናዊ ጣብያ ከፍታዎች መካከል ያለው ስርጭት -20 bp ነው፣ይህም ከቁጥጥር ስርጭቱ በእጅጉ ይለያል፣ይህም በCLL አጭር ንባብ ቅደም ተከተሎች ከተዘገበው ጋር ተመሳሳይ ነው።የ ERGIC3 ጂን አይሶፎርሞች ተተነተኑ፣ በSF3B1-K700E ውስጥ የፕሮክሲማል ስፕሊስ ቦታን የያዘ ልብ ወለድ አይዞፎርም በብዛት ተገኝቷል።ሁለቱም ፕሮክሲማል እና የርቀት 3'SS ብዙ አይዞፎርሞችን ከሚያመነጩ የ AS ቅጦች ጋር ተቆራኝተዋል።

ምስል 2. ተለዋጭ 3′ የተከፋፈሉ ቅጦች በ nanopore ተከታታይ መረጃ ተለይተው ይታወቃሉ

የ IR ክስተት አጠቃቀም ትንተና በ IR መለያ እና መጠን ላይ ባለው እምነት ምክንያት በአጭር-ተነባቢ ትንተና ለረጅም ጊዜ ተገድቧል።በ SF3B1-K700E እና SF3B1-WT ውስጥ የ IR isoforms መግለጫዎች በናኖፖር ቅደም ተከተሎች ላይ ተመስርተው በ SF3B1-K700E ውስጥ የ IR isoforms ዓለም አቀፋዊ ቁጥጥርን ያሳያል።

ምስል 4. የግብርና ጥንካሬ እና የኔትወርክ ትስስር በሶስት የእርሻ ስርዓቶች (A እና B);የዘፈቀደ የደን ትንተና (ሲ) እና በግብርና ጥንካሬ እና በኤኤምኤፍ ቅኝ ግዛት (ዲ) መካከል ያለው ግንኙነት

ምስል 3. የመግቢያ ማቆያ ክስተቶች በ CLL SF3B1-K700E ውስጥ በጣም ጠንከር ያለ ቁጥጥር ይደረግባቸዋል

ቴክኖሎጂ

ናኖፖሬ ለረጅም ጊዜ የተነበበ ቅደም ተከተል

Nanopore sequencing አንድ ነጠላ ሞለኪውል የእውነተኛ ጊዜ የኤሌክትሪክ ምልክት ቅደም ተከተል ቴክኖሎጂ ነው።
Dባለ ሁለት ክር ያለው ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ በባዮፊልም ውስጥ ከተከተተ እና በሞተር ፕሮቲን መሪነት ከሚወጣው ናኖፖራል ፕሮቲን ጋር ይተሳሰራል።
Dየኤንኤ / አር ኤን ኤ ክሮች በቮልቴጅ ልዩነት ተግባር ውስጥ በተወሰነ ፍጥነት በናኖፖር ሰርጥ ፕሮቲን ውስጥ ያልፋሉ።
Molecules በኬሚካላዊ መዋቅር መሰረት የተለያዩ የኤሌክትሪክ ምልክቶችን ያመነጫሉ.
Rየቅደም ተከተል ቅደም ተከተሎችን ማወቅ የሚገኘው በመሠረታዊ ጥሪ ነው።