METAGENOMIKA
Volledige, geslote bakteriese genome van mikrobiome met behulp van nanopore-volgordebepaling
Nanopore-volgorde |Metagenomika |MAG's |Bakteriële genoom sirkulasie |Ingewande mikrobiota
Hoogtepunte
1. 'n Nuwe metode om lang fragmente van DNS te onttrek is in hierdie studie aangebied, wat ekstraksie verkry het van mikrogram suiwer, HMW DNS wat geskik is vir langleesvolgordebepaling vanaf 300 mg stoelgang
2. 'n Monteerwerkvloei, Draaibank, is in hierdie studie bekendgestel, waar MAG's saamgestel is deur lang leeswerk en reggestel is deur kort lees.
3.Draaibank is geëvalueer deur skynmengsel.7 uit 12 bakterieë is suksesvol saamgestel in enkele kontiges en 3 is saamgestel in vier of minder kontiges.
4.Draaibank is verder toegepas op stoelmonsters, wat 20 gesirkuleerde genome gegenereer het, insluitend Prevotella copri en kandidaat Cibiobacter sp., wat bekend was daarvoor dat hulle ryk was aan mobiele genetiese elemente.
Hoofprestasie
Onttrekkingsprotokol vir HWM DNA
Langlees-volgordebepaling-gebaseerde derm-metagenomiese studies is lank gely van hardheid in die onttrekking van hoë molekulêre gewig (HMW) DNA uit stoelgang.In hierdie studie is 'n ensiem-gebaseerde ekstraksieprotokol ingestel om uitgebreide skeerwerk deur kraleklop in tradisionele metodes te vermy.Soos getoon in die volgende figuur, is die monsters eerstens behandel met 'n skemerkelkie van ensieme, insluitend lytiese ensiem, MetaPolyzyme, ens. om selwande af te breek.Vrygestelde DNA is onttrek deur Fenol-chloroform sisteem, gevolg deur Proteïenase K en RNase A vertering, kolom-gebaseerde suiwering en SPRI grootte seleksie.Hierdie metode het daarin geslaag om mikrogram HMW-DNS uit 300 m stoelgang te lewer, wat voldoen aan langlees-volgordebepalingsvereistes in terme van beide kwaliteit en kwantiteit.
Figuur 1. HWM DNA ekstraksie skema
Skema vloei van Draaibank
Soos beskryf in die volgende figuur, bevat Draaibank bestaande proses van rou basisoproepproses wat Guppy gebruik.Twee langleessamestellings word dan afsonderlik deur Flye en Canu vervaardig, gevolg deur opsporing en verwydering van verkeerde samestelling.Die twee sub-samestellings word saamgevoeg met quickmerge.By samesmelting word groot samestellings op megabasisvlak dan nagegaan vir sirkulasie.Vervolgens word konsensusverfyning oor hierdie gemeentes met kort leeswerk verwerk.Finale saamgestelde bakteriese genome word verwerk vir finale wansamestelling opsporing en verwydering.
Figuur 2. Skemavloei van Draaibanksamestelling
Evaluering van Draaibank met skynbakteriemengsel
'n Standaard ATCC 12-spesie mengsel wat beide Gram-positiewe en Gram-negatiewe bakterieë bevat, is gebruik om die werkverrigting van nanopore-volgordebepalingsplatform en Draaibank in MAG-samestelling te evalueer.'n Totaal van 30.3 Gb data is gegenereer deur nanopore platform met N50 van 5.9 kb.Draaibank het samestelling N50 grootliks verbeter tot 1,6 tot 4-voudig in vergelyking met ander langlees-monteergereedskap en 2 tot 9-voudig in vergelyking met gebasterde monteergereedskap.Van 12 bakteriese genome, is sewe in enkelgroepe saamgestel (Figuur 3. Circos met swart kolletjie).Nog drie is saamgestel in vier of minder contigs, waarin die mees onvolledige samestelling 83% van die genoom in 'n enkele contig bevat het.
Figuur 3. Genoomsamestellings in 'n gedefinieerde 12-spesie bakteriese mengsel
Toepassing van Draaibank in stoelmonsters
Hierdie metode is verder toegepas op menslike stoelgangmonsters om die organisme-identifikasie en samestelling aaneenlopend te vergelyk met bestaande metodes, lees-wolk en kortlees-gebaseerde analise.Uit die drie betrokke monsters het die nuwe ensiem-gebaseerde ekstraksie ten minste 1 μg per 300 mg insetmassa gelewer.Nanopore-volgordebepaling van hierdie HMW-DNS het langlesings gegenereer met N50 van onderskeidelik 4.7 kb, 3.0kb en 3.0kb.Die huidige metode het veral groot potensiaal getoon in mikrobiese opsporing in vergelyking met bestaande metodes.Relatief hoër spesievlak alfa diversiteit is hier getoon in vergelyking met kortlees en leeswolk.Boonop is alle genera van kortleesanalise, selfs tipies lisis-weerstandige Gram-positiewe organismes, deur hierdie metode herwin.
Figuur 4. Alfa-diversiteit en taksonomiese komponente bepaal deur Nanopore, kortlees- en leeswolkmetodes
Draaibank het baie langer heelsamestelling N50 opgelewer as kortlees- en leeswolksamestelling, ten spyte van 'n drie- tot ses keer laer insette van rou data.Konsepgenome is geproduseer deur contig binning, waarin die konsepte geklassifiseer is in "hoë kwaliteit" of "gedeeltelik" gebaseer op volledigheid, kontaminasie, enkelkopie kerngene, ens. na kortlees en lees-wolk.
Figuur 5. Per-organisme-samestelling aaneengeslotenheid van elke metode
Boonop is die huidige samestellingsbenadering in staat om geslote, sirkelvormige genome te lewer.In die stoelmonsters is agt hoë-gehalte, enkel-aaneenlopende genome saamgestel en vyf hiervan het presiese sirkulasie bereik.Langleesbenadering het ook indrukwekkende kapasiteit getoon om herhalende elemente in genome op te los.OmsendbriefP. coprigenoom is gegenereer deur hierdie benadering, wat bekend is dat dit 'n hoë mate van volgordeherhaling bevat.Die beste samestelling van hierdie genoom deur kortlees en leeswolk het nooit N50 van 130 kb oorskry nie, selfs met dekkingsdiepte van 4800X.Hierdie hoë kopiegetal elemente is volledig opgelos deur langleesbenadering, wat dikwels by breekpunte van kortlees- of leeswolksamestellings gevind word.Nog 'n geslote genoom is gerapporteer in hierdie studie, wat glo 'n lid van onlangs beskryfCibiobakterklade.Vyf vermeende fage is in hierdie geslote samestelling geïdentifiseer, wat wissel van 8.5 tot 65.9 kb.
Figuur 6. Circos-diagram van geslote genome van P.copri en Cibiobacter sp.
Verwysing
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Volledige, geslote bakteriese genome van mikrobiome met behulp van nanopore-volgordebepaling.Natuur biotegnologie,38(6), 701-707.
Tegnologie en hoogtepunte beoog om die mees onlangse suksesvolle toepassing van verskillende hoë-deurset-volgorde-tegnologieë in verskeie navorsingsarena te deel, asook briljante idees in eksperimentele ontwerp en data-ontginning.
Postyd: Jan-07-2022