TRANSKRIPTOMIE
aard
KOMMUNIKASIE
Vollengte transkripsie karakterisering van SF3B1 mutasie in chroniese limfositiese leukemie openbaar afregulering van behoue introne
Vollengte transkripsies|Nanopore-volgorde|Alternatiewe isovormanalise
Agtergrond
SOmatiese mutasies in splitsingsfaktor SF3B1 is wyd gerapporteer om te assosieer met verskeie kankers, insluitend chroniese limfositiese leukemie (CLL), uveale melanoom, borskanker, ens. Boonop het kortgeleesde transkriptomiese studies afwykende splitsingspatrone aan die lig gebring wat deur SF3B1-mutasies geïnduseer is.Studies oor hierdie alternatiewe splitsingspatrone is egter lank beperk tot gebeurtenisvlak en gebrek aan kennis oor isovormvlak as gevolg van die beperking van kortgeleesde saamgestelde transkripsies.Hier is nanopore-volgordebepalingsplatform bekendgestel om vollengte-transkripsies te genereer, wat bemagtiging op AS-isovorme bemagtig het.
Eksperimentele ontwerp
Eksperimente
Groepering:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutasie);3. Normale B-selle
Opeenvolgingstrategie:MinION 2D biblioteek volgordebepaling, PromethION 1D biblioteek volgorde;kortleesdata van dieselfde monsters
Volgorde-platform:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatiese analise
Resultate
Atotaal van 257 miljoen lesings is gegenereer uit 6 CLL-monsters en 3 B-selle.Gemiddeld 30,5% van hierdie leesstukke is as vollengte-transkripsies geïdentifiseer.
Ful-lengte alternatiewe isovorm analise van RNA(FLAIR) is ontwikkel om 'n stel hoë-vertroue isovorme te genereer.FLAIR kan opgesom word as:
Nanopore lees belyning: identifiseer algemene transkripsiestruktuur gebaseer op verwysingsgenoom;
Splice-aansluitingskorreksie: korrigeer volgordefoute (rooi) met splitsingsplek vanaf óf geannoteerde introne, introne van kortleesdata óf albei;
Collapse: som verteenwoordigende isovorme op gebaseer op lasverbindingskettings (eerste-deurgang-stel).Kies 'n hoë-vertroue isofrom gebaseer op die aantal ondersteunende leeswerk (drempel: 3).
Figuur 1. FLAIR-analise om volle lengte isovorme te identifiseer wat met SF3B1-mutasie in CLL geassosieer word
FLAIR het 326 699 hoë-vertroue gesplitste isovorme geïdentifiseer, waarvan 90% nuwe isovorme is.Daar is gevind dat die meeste van hierdie ongeannoteerde isovorme nuwe kombinasies van bekende splitsingsverbindings is (142 971), terwyl die res nuwe isovorme óf behoue intron (21 700) óf nuwe ekson (3594) bevat het.
Long-lees volgordes bemagtig identifikasie van mutante SF3B1-K700E-veranderde splitsingsplekke op isovormvlak.Daar is gevind dat 35 alternatiewe 3'SS'e en 10 alternatiewe 5'SS'e betekenisvol differensieel gesplits is tussen SF3B1-K700E en SF3B1-WT.33 van die 35 veranderings is nuut ontdek deur langleesreekse.In Nanopore-data is die verspreiding van afstand tussen SF3B1-K700E-veranderde 3'SS'e na kanoniese terreinpieke ongeveer -20 bp, wat aansienlik verskil van 'n kontroleverspreiding, soortgelyk aan wat in CLL-kortleesreekse gerapporteer is.Isovorme van ERGIC3 geen is ontleed, waar 'n nuwe isovorm wat die proksimale splitsingsplek bevat meer volop gevind is in SF3B1-K700E.Beide proksimale en distale 3'SS was geassosieer met onderskeie AS-patrone wat veelvuldige isovorme genereer.
Figuur 2. Alternatiewe 3'-splytingpatrone geïdentifiseer met nanopore-volgordedata
IR-gebeurtenisgebruiksanalise is lank beperk in kortleesgebaseerde analise as gevolg van vertroue in IR-identifikasie en -kwantifisering.Uitdrukking van IR-isovorme in SF3B1-K700E en SF3B1-WT is gekwantifiseer op grond van nanopore-volgordes, wat 'n globale afregulering van IR-isovorme in SF3B1-K700E openbaar.
Figuur 4. Landbou-intensiteit en netwerkverbinding oor drie boerderystelsels (A en B);Ewekansige woudanalise(C) en Verwantskap tussen landbou-intensiteit en AMF-kolonisasie (D)
Figuur 3. Intron retensie gebeure word sterker afgereguleer in CLL SF3B1-K700E
Tegnologie
Nanopore Langlees-volgorde
Nanopore-volgordebepaling is 'n enkele molekule intydse elektriese seinvolgorde-tegnologie.
Double-stringed DNA of RNA sal bind aan nanoporeuse proteïen wat in die biofilm ingebed is en onder die leiding van motorproteïen afwikkel.
DNA/RNA-stringe gaan teen 'n sekere tempo deur nanopore-kanaalproteïen onder die werking van spanningsverskil.
Molekules genereer verskillende elektriese seine volgens chemiese struktuur.
Real-time opsporing van rye word bereik deur basisoproepe.
Prestasie van vollengte-transkripsievolgordebepaling
√ Dataversadiging
7 keer minder leeswerk benodig om vergelykbare dataversadiging te bereik.
√ Transkripsiestruktuuridentifikasie
Identifikasie van diverse strukturele variante met konsensus vollengte-uitlees van elke transkripsie
√ Transkripsievlak-differensiële analise - Onthul veranderinge wat deur kortlesings versteek word
Verwysing
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Vollengte transkripsie karakterisering van SF3B1 mutasie in chroniese limfositiese leukemie openbaar afregulering van behoue introne [J].Natuur kommunikasie.
Tegnologie en hoogtepunte beoog om die mees onlangse suksesvolle toepassing van verskillende hoë-deurset-volgorde-tegnologieë in verskeie navorsingsarena te deel, asook briljante idees in eksperimentele ontwerp en data-ontginning.
Postyd: Jan-08-2022