Vollengte mRNA-volgordebepaling-Nanopore
Diensvoordele
● Lae volgorde vooroordeel
● Onthulling van vollengte cDNA-molekules
● Minder data benodig om dieselfde aantal transkripsies te dek
● Identifikasie van veelvuldige isovorme per geen
● Uitdrukkingskwantifisering in isovormvlak
Diensspesifikasies
| Biblioteek | Platform | Aanbevole data-opbrengs (Gb) | Kwaliteitsbeheer |
| cDNA-PCR (Poly-A verryk) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/monster (Afhangende van spesie) | Vollengte verhouding＞70% Gemiddelde kwaliteit telling: V10
|
Bioinformatika-ontledings
●Rou data verwerking
● Transkripsie-identifikasie
● Alternatiewe splitsing
● Uitdrukkingskwantifisering in geenvlak en isovormvlak
● Differensiële uitdrukking analise
● Funksie-annotasie en -verryking (DEG's en DET's)
Voorbeeldvereistes en aflewering
Voorbeeldvereistes:
Nukleotiede:
| Kons.(ng/μl) | Hoeveelheid (μg) | Reinheid | Integriteit |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Beperkte of geen proteïen- of DNA-kontaminasie word op gel gewys. | Vir plante: RIN≥7.0; Vir diere: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; beperkte of geen basislyn hoogte nie |
Weefsel: Gewig (droog): ≥1 g
*Vir weefsel kleiner as 5 mg, beveel ons aan om flitsbevrore (in vloeibare stikstof) weefselmonster te stuur.
Selsuspensie: Seltelling = 3×106- 1×107
*Ons beveel aan om bevrore sellisaat te stuur.As daardie sel kleiner as 5×10 tel5, word flitsbevries in vloeibare stikstof aanbeveel, wat verkieslik is vir mikro-ekstraksie.
Bloedmonsters: Volume≥1 ml
Aanbevole voorbeeldaflewering
Houer: 2 ml sentrifugeerbuis (tinfoelie word nie aanbeveel nie)
Monsteretikettering: Groep+repliseer bv. A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Versending: 2、 Droë-ys: Monsters moet in sakke verpak en in droë-ys begrawe word.
- RNA-stabiele buise: RNA-monsters kan in RNA-stabiliseringsbuise (bv. RNAstable®) gedroog word en in kamertemperatuur versend word.
Dienswerkvloei
Nukleotiede:
Voorbeeld aflewering
Biblioteek konstruksie
Opeenvolging
Data-analise
Na-verkope dienste
Dienswerkvloei
Sneesdoekie:
Eksperiment ontwerp
Voorbeeld aflewering
RNA-ekstraksie
Biblioteek konstruksie
Opeenvolging
Data-analise
Na-verkope dienste
1.Differensiële uitdrukking analise -Vulkaan plot
Differensiële uitdrukking-analise kan in beide geenvlak verwerk word om differensieel uitgedrukte gene (DEG's) te identifiseer en in isovormvlak om differensieel te identifiseer
uitgedrukte transkripsies (DET's)
2.Hiërargiese groepering hittekaart
3.Alternatiewe splitsing identifikasie en klassifikasie
Vyf tipes alternatiewe splitsingsgebeure kan deur Astalavista voorspel word.
4.Alternatiewe poli-adenilasie (APA) gebeurtenisidentifikasie en motief by 50 bp stroomop van poli-A
BMK saak
Alternatiewe splitsing identifikasie en isovormvlak kwantifisering deur nanopore vollengte transkripsievolgordebepaling
Gepubliseer:Natuurkommunikasie, 2020
Opeenvolgingstrategie:
Groepering: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutasie);3. Normale B-selle
Volgordebepalingstrategie: MinION 2D-biblioteekvolgordebepaling, PromethION 1D-biblioteekvolgordebepaling;kortleesdata van dieselfde monsters
Volgorde-platform: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Sleutel resultate
1.Isoform-vlak Alternatiewe Splicing Identifikasie
Langleesreekse bemagtig identifikasie van mutante SF3B1K700E-veranderde splitsingsplekke op isovormvlak.Daar is gevind dat 35 alternatiewe 3'SS'e en 10 alternatiewe 5'SS'e beduidend differensieel gesplits is tussen SF3B1K700Een SF3B1WT.33 van die 35 veranderings is nuut ontdek deur langleesreekse.
2.Isoform-vlak Alternatiewe Splicing kwantifisering
Uitdrukking van intronretensie(IR) isovorme in SF3B1K700Een SF3B1WTis gekwantifiseer gebaseer op nanopore-volgordes, wat 'n globale afregulering van IR-isovorme in SF3B1 openbaarK700E.
Verwysing
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Vollengte transkripsie karakterisering van SF3B1 mutasie in chroniese limfositiese leukemie openbaar afregulering van behoue introne [J].Natuur kommunikasie.
