Vollengte mRNA-volgordebepaling -PacBio
Diensvoordele
● Direkte uitlees van vollengte cDNA-molekule van 3'-end tot 5'-end
● Iso-vorm vlak resolusie in volgorde struktuur
● Transkripsies met hoë akkuraatheid en integriteit
● Hoogs versoenbaar met vaiours spesies
● Groot volgorde-vermoë met 4 PacBio Sequel II-volgorde-platforms toegerus
● Hoogs ervare met meer as 700 Pacbio-gebaseerde RNA-volgordebepalingsprojekte
● BMKCloud-gebaseerde resultaatlewering: Pasgemaakte data-ontginning beskikbaar op platform.
● Na-verkope dienste geldig vir 3 maande na projek voltooiing
Diensspesifikasies
Platform: PacBio Sequel II
Volgordebepalingsbiblioteek: Poly A-verrykte mRNA-biblioteek
Aanbevole data-opbrengs: 20 Gb/monster (Afhangende van spesie)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Vollengte nie-chimeriese transsipte
Bioinformatika-ontledings
● Verwerking van rou data
● Transkripsie-identifikasie
● Volgordestruktuur
● Uitdrukkingskwantifisering
● Funksie Annotasie
Voorbeeldvereistes en aflewering
Voorbeeldvereistes:
Nukleotiede:
| Kons.(ng/μl) | Hoeveelheid (μg) | Reinheid | Integriteit |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Beperkte of geen proteïen- of DNA-kontaminasie word op gel gewys. | Vir plante: RIN≥7.5; Vir diere: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; beperkte of geen basislyn hoogte nie |
Weefsel: Gewig (droog):≥1 g
*Vir weefsel kleiner as 5 mg, beveel ons aan om flitsbevrore (in vloeibare stikstof) weefselmonster te stuur.
Selsuspensie:Seltelling = 3×106- 1×107
*Ons beveel aan om bevrore sellisaat te stuur.As daardie sel kleiner as 5×10 tel5, word flitsbevries in vloeibare stikstof aanbeveel, wat verkieslik is vir mikro-ekstraksie.
Bloedmonsters:Volume≥1 ml
Mikro-organismes:Massa ≥ 1 g
Aanbevole voorbeeldaflewering
Houer:
2 ml sentrifugeerbuis (tinfoelie word nie aanbeveel nie)
Monsteretikettering: Groep+repliseer bv. A1, A2, A3;B1, B2, B3 ... ...
Versending:
1. Droë-ys: Monsters moet in sakke verpak en in droë-ys begrawe word.
2. RNA-stabiele buise: RNA-monsters kan in RNA-stabiliseringsbuise (bv. RNAstable®) gedroog word en in kamertemperatuur versend word.
Dienswerkvloei
Eksperiment ontwerp
Voorbeeld aflewering
RNA-ekstraksie
Biblioteek konstruksie
Opeenvolging
Data-analise
Na-verkope dienste
1.FLNC lengte verspreiding
Lengte van vollengte nie-chimeriese lees (FLNC) dui die lengte van cDNA in biblioteekkonstruksie aan.FLNC-lengteverspreiding is 'n belangrike aanwyser in die evaluering van kwaliteit van biblioteekkonstruksie.
FLNC lees lengte verspreiding
2. Voltooi ORF-streeklengteverspreiding
Ons gebruik TransDecoder om proteïenkoderende streke en ooreenstemmende aminosuurvolgordes te voorspel om unigeen-stelle te genereer, wat volledige nie-oortollige transkripsie-inligting in alle monsters bevat.
Voltooi ORF-streeklengteverspreiding
3.KEGG-wegverrykingsanalise
Differensieel uitgedrukte transkripsies (DET's) kan geïdentifiseer word deur NGS-gebaseerde RNA-volgordebepalingsdata op vollengte-transkripsiestelle gegenereer deur PacBio-volgordedata in lyn te bring.Hierdie DET's kan verder verwerk word vir verskeie funksionele analises, bv. KEGG-wegverrykingsanalise.
DET KEGG pad verryking -Dot plot
BMK saak
Die ontwikkelingsdinamika van die Populus stamtranskriptoom
Gepubliseer: Plant Biotegnologie Tydskrif, 2019
Opeenvolgingstrategie:
Voorbeeldversameling:stamstreke: toppunt, eerste internode(IN1), tweede internode(IN2), derde internode(IN3), internode(IN4) en internode(IN5) van Nanlin895
NGS-volgorde:RNA van 15 individue is saamgevoeg as een biologiese monster.Drie biologiese replikate van elke punte is vir NGS-volgorde verwerk
TGS-volgorde:Stamstreke is in drie streke verdeel, naamlik toppunt, IN1-IN3 en IN4-IN5.Elke streek is verwerk vir PacBio-volgordebepaling met vier tipes biblioteke: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb en 3-10 kb.
Sleutel resultate
1. 'n Totaal van 87150 vollengte-transkripsies is geïdentifiseer, waarin 2081 nuwe isovorme en 62058 nuwe alternatiewe gesplitste isovorme geïdentifiseer is.
2.1187 lncRNA en 356 samesmeltingsgene is geïdentifiseer.
3.Van primêre groei tot sekondêre groei is 15838 differensieel uitgedrukte transkripsies van 995 differensieel uitgedrukte gene geïdentifiseer.In alle DEG's was 1216 transkripsiefaktore, waarvan die meeste nog nie gerapporteer is nie.
4.GO-verrykingsanalise het die belangrikheid van seldeling en oksidasie-reduksieproses in primêre en sekondêre groei aan die lig gebring.
Alternatiewe splitsingsgebeure en verskillende isovorme
WGCNA-analise op transkripsiefaktore
Verwysing
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.Die ontwikkelingsdinamika van die Populus stamtranskriptoom.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
